Сравнительная характеристика лабораторно-диагностических методов исследований на ЗППП

Сравнительная характеристика лабораторно-диагностических

методов исследований на ЗППП

   Нормальная микрофлора влагалища у женщин репродуктивного возраста включает аэробные и анаэробные виды бактерий, при этом преобладают анаэробы. Микрофлора влагалища очень тесно связана с количеством эстрогенов  в организме. У новорожденных детей  в течение первых 5 – 6 дней сохраняется влагалищная микрофлора матери.

   В препубертатном периоде у девочек  лактобациллы редки или их очень мало. Гарднереллы,  микоплазмы и дрожжеподобные грибы также встречаются очень редко.

   В репродуктивном возрасте у 92% женщин влагалище колонизировано лактобациллами, почти у половины (46%) – гарднереллами и у 31% дрожжеподобными грибами рода Candida. Также могут встречаться в небольшом количестве Staph. aureus, epidermalis; Strept.; Esherichia coli; Micoplasma hom. –  у 15%; Ureoplasma ureal. и другие.  Эти данные следует учитывать при лабораторной диагностике, не считая колонизацию этими микроорганизмами патологическим процессом.

   В постменопаузе, если не проводится замещающая терапия,  снижается частота колонизации влагалища лактобациллами, гарднереллами, генитальными микоплазмами и превотеллами. Другие виды бактерий, по-видимому, не находятся под эстрогенным контролем.

   Имеет место изменение нормальной микрофлоры в течение менструального цикла. Дни, когда доминирует лактобациллярная микрофлора, сменяются днями, когда преобладают Gardnerella vaginalis и Bacteroides spp. Влагалищная экосистема динамична, а такие состояния, как бактериальный вагиноз и кандидоз, проявляются перемежающимся образом.

   Во время менструального кровотечения и после полового акта количество лактобацилл снижается. Это происходит вследствие повышения рН среды влагалища. Во время менструации незначительно снижается количество лактобацилл и повышается количество анаэробов. После полового акта происходит нарастание количества Esherichia coli, энтерококков и стрептококков группы В.  

   Эстрогены способствуют депозиту гликогена, который является оптимальным субстратом для роста лактобацилл. Кислая среда способствует размножению кислотоустойчивых видов микроорганизмов и ограничивает рост др. бактерий. Лактобациллы продуцируют  энзимы, образующие перекись водорода, которая обладает антибиотическими (токсическими) свойствами.

  Среди защитных неспецифических факторов в половых путях в первую очередь следует отметить слизь, она секретируется в первую очередь на поверхности слизистых оболочек и обеспечивает ряд защитных функций:

– любрикация (смазывание и избирательное отделение эпителия от эндогенных молекул);

– слизь богата углеводами, которые препятствуют адгезии бактерий к эпителиальной клетке;

–  содержится  лизоцим,  лактоферон,  антимикробные пептиды.

  Изложенные сведения дают представления о сложности правильного проведения лабораторной диагностики, интерпретации полученных результатов.

   Методы выявления  патогенных возбудителей при заболеваниях, передающихся половым путем, могут быть условно подразделены: микроскопические (бактериоскопические), серологические, культуральные (бактериологические и культура клеток), молекулярно-биологические. В свою очередь все методы можно подразделить на методы прямой детекции возбудителя и непрямые методы выявления возбудителя.

  К первым относятся:

– микробиологические исследования – выделение чистой культуры возбудителя и определение его чувствительности к различным антибиотикам;

– бактериоскопическое (цитологическое  исследование  мазков);

– реакция иммунной флюорисценции – выявление антигенов возбудителя при помощи родо-, видоспецифических антител;

– молекулярно-биологические методы – определение специфического участка ДНК/ РНК в геноме возбудителя (ПЦР, ЛЦР), а также ДНК-гибридизация.

   Ко вторым можно причислить:

–серологические методы – определение специфических антител, ответ на возбудителя – ИФА, РСК и др.;

– методы экспресс-диагностики – иммунохроматографические и ферментспецифические (скрининговые тесты).

 Все существующие методы разрешены  к постановке приказами МОЗ Украины №286. Только подтверждение наличия гонореи у детей требует обязательного бактериального посева на ленте сахаров.

    До настоящего времени одним из наиболее чувствительных и высоко специфических   методов выявления ИППП является культуральный. Этот метод, часто называют “золотым” стандартом. Чувствительность и специфичность бактериологической диагностики высока и достигает, при выполнении всех необходимых требований и наличия квалифицированного персонала,  90 – 95% достоверности.   Культуральная диагностика является  сложная в исполнении, требующая особых условий и времени (некоторым микроорганизмам для роста нужны несколько дней или даже недель). Кроме того, некоторые микроорганизмы трудно культивируются и требуют особых условий для роста на питательной среде. Этот метод чаще всего применяется для выявления гонореи, микоплазм, уреоплазм, иногда  трихомонад.

  Недостатки: трудоемкость, длительность (4 – 7дней), проблемы с воспроизводимостью, необходимость дорогостоящего оборудования, реактивов, инструментария, посуды.

  Другой метод позволяющий осуществлять прямое визуальное исследование – микроскопический (бактериоскопический). Диагностика основана на исследовании нативных или окрашенных препаратов.

  Для выявления трихомониаз,  гонорейная инфекция, бактериальный вагиноз или вагинит достаточно обнаружения возбудителей в обычных препаратах на флору, окрашенных по Граму или  метиленовым синим. В отношении  хламидийной инфекции  этот метод малоинформативен, так как  имеет низкую чувствительность (не более 20 – 40%), субъективен. Примение его для диагностики хламидий целесообразно при острых формах заболеваний (коньюктивите новорожденных,  глазных инфекциях у взрослых), а также при отсутствии современных методов диагностики.

Реакция имммунофлюорисценции (РИФ, ПИФ, РНИФ).

  ПИФ – прямая иммунофлюорисцентная реакция, предполагает обработку препарата непосредственно специфическими моно- или поликлональными антителами, мечеными флюорисцином (ФИТЦ). При использовании РНИФ препарат обрабатывается сначала иммунной сывороткой, содержащей немеченые антитела  к исследуемому антигену,  а затем антивидовой флуорисцирующей сывороткой.

    Этот метод широко используется в практике, он достаточно специфичен и позволяет обнаружить антиген с чувствительностью  64 –   91% при условии качественного диагностикума, выполнения требований инструкции, грамотного забора материала, а также высокого профессионализма врача-лаборанта. Определенные трудности вызывает чтение результатов в случаях обнаружения единичных гранул при исследовании на хламидии, микоплазмы и уреоплазмы.   Затратное время на одно исследование составляет 30 – 40 минут. Метод удобен тем, что инфекционный агент обнаруживают в месте поражения (уретре, влагалище, цервикальном канале,  глазах).

  Ложноотрицательные результаты бывают при неправильном заборе материала (малое количество эпителиальных клеток в препарате), большом количестве слизи и лейкоцитов. Ложноположительный результат – следствие неспецифического связывания антител с неинфицированным материалом, недостаточная очистка моноклональных антител дает неспецифическое свечение. Иногда при резко выраженном кандидозе могут быть получены ложноположительные ответы на хламидии, микоплазмы, уреоплазмы.  В случае получения сомнительных результатов, при отсутствии клинической симптоматики, следует повторить исследование или использовать более чувствительные методы (культуральный , ПЦР).

  Контроль излеченности  трихомониаза и гонореи методом РИФ следует проводить не ранее чем через 2 недели, а  хламидиоза, микоплазмоза, уреоплазмоза, ВПГ и ЦМВ не ранее чем через 72дня.

    Недостатки: метод –  субъективный, зависит от взятия материала, требует хорошей подготовки врача-лаборанта.

                                             Иммуноферментный анализ (ИФА)

   Широко применяется при обнаружении возбудителей многих инфекционных заболеваний, является косвенным методом, основан на реакции “антиген-антитело”. При взаимодействии патогенных возбудителей – антигенов с клетками микроорганизма в организме вырабатывается  ответ антител в виде различных классов: IgM, IgG, IgA, циклических иммунных комплексов, которые определяются в реакции.

  Специфичность метода доходит до 80%,  он отличается простатой в постановке, оценка результатов объективна. Быстрота, с которой получают результаты, удобна для проведения скрининга больших объемов проб. В клинической практике установлено, что чувствительность метода ИФА к хламидиям при острой форме  44 – 70%. Не высокая чувствительность обусловлена  со слабой иммуногенностью хламидий, существенно зависит от качества тест-систем. При бессимптомных формах, ввиду отсутствия сероконверсии, выявление титра антител не превышает  50%.

  При хронических и стертых формах инфекции эффективность применения ИФА наиболее низка, он не столько свидетельствует о наличии инфекции  в организме, сколько отражает особенности реакции иммунной системы на инфекционный агент.      

 Выявление трихомонадой инфекции методом ИФА намного ниже, составляет всего 25 – 40%.  

 Ложноотрицательные и ложноположительные результаты  обусловлены индивидуальными особенностями иммунной системы организма пациента, штаммов микроорганизма, перекрестными реакциями. Наблюдались случаи, когда у ВИЧ-инфицированных пациентов, в связи с гипериммуноглобулинемией были ложноположительные результаты. При наличии слабого иммунного ответа получались ложноотрицательные результаты.

Молекулярно-биологические методы диагностики

   Методы разнообразны и основаны на принципе комплементарности – способности цепей ДНК распознавать друг друга с высокой степенью специфичности, что позволяет идентифицировать микроорганизмы.  Наиболее распространен метод ПЦР (полимеразная цепная реакция) в процессе гибридизации лежит способность ДНК восстанавливать структуру двойной спирали.

   Метод ПЦР  используется для выявления инфекционных агентов в уретральных и эндоцервикальных образцах, в моче.

Достоинства ПЦР: высокая чувствительность определения широкого спектра возбудителей в  клиническом образце, т. е. получение “микробиологического паспорта”  всех возбудителей в исследуемой клинической пробе;  получение результата в течение нескольких часов, что значительно быстрее, чем при проведении культуральных исследований; метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, при соблюдении  специальных условий  для проведения постановки реакции, четком выполнении  инструкций к тест-системам, правильном заборе и хранении материала.    

    Использование метода ПЦР  не является гарантией от получения ошибочных, недостоверных результатов диагностики.  Причиной ложноположительных результатов ПЦР является перекрестная контаминация продуктами импликации. При избирательном размножении участка ДНК (ампликона) возбудителя  может происходить выделение его микроколичеств   в воздух рабочего помещения, происходящая при этом контаминация воздуха, рабочей поверхности, пипеток, перчаток  с высокой вероятностью приводит к  попаданию ампликона в исследуемые пробы.

        Ложноотрицательные результаты возникают вследствие присутствия в клинических образцах веществ, которые ингибируют реакцию ПЦР. Они практически  непредсказуемы и определяются только повторным анализом. Ложноотрицательные результаты наиболее вероятны при анализе осадка мочи, уретральных или вагинальных препаратов с большим количеством лейкоцитов, так как они содержат ингибирующие субстанции.

Сравнительная характеристика разных методов исследований.

 

Бактериоск

Культурал.

РИФ

ИФА

ПЦР

%

Чувств

Специф

Чувств

Специф

Чувств

Специф

Чувств

Специф

Чувств

Специф

Ch. Trachomatis

45-62

95

80-90

95

80-92

95-98

60-80

95

90-93

96-98

Trichomonas vag.

50-75

99

25-90

95

70-90

95

65-90

99

 

 

M. hominis

Не рекоменд.

80-90

95

90-93

96-98

60-83

90-98

90-93

96-98

U. urealyticum

Не рекоменд.

80-90

95

90-93

96-98

60-83

90-98

90-93

96-98

Neissera gonor.

45-65

90-99

50-85

99

90-95

95-99

Не рекоменд.

95-99

99

ВПГ

80-90

80-90

80-90

80-90

80-90

80-90

80-90

80-90

80-90

80-90

ЦМВ

80-90

80-90

Не рекоменд.

80-90

80-90

80-90

80-90

80-90

80-90

      Контроль лечения  рекомендуется проводить тем же методом, что и при получении первого положительного результата. Метод ПЦР не рекомендуется для постановки контроля излеченности, так как положительный результат может оставаться очень долго.  

 

Врач- лаборант Центра планирования семьи                           Г. Ф. Бойко

 

Врач- лаборант Центра планирования семьи                           О. В. Андриишина

 

Comments